Cum se face tampon TBE în 3 pași simpli

Tamponul TBE este o soluție tampon formată din bază Tris, acid boric și EDTA (sau Tris-borat-EDTA în totalitate). Acest tampon este adesea folosit pentru electroforeza pe gel de agaroză în analiza produselor ADN rezultate din amplificarea PCR, protocoalele de purificare a ADN-ului sau experimentele de clonare a ADN-ului.

Tamponul TBE este deosebit de util pentru separarea fragmentelor de ADN mai mici (MW <1000), cum ar fi produsele mici de digerare cu enzime de restricție. TBE are o capacitate de tamponare mai mare și va oferi o rezoluție mai clară decât tamponul TAE. TAE tampon este o soluție formată din bază Tris, acid acetic și EDTA (Tris-acetat-EDTA).

TBE este în general mai scump decât TAE și inhibă ADN ligaza, ceea ce poate provoca probleme dacă se intenționează etapele ulterioare de purificare și legare a ADN-ului. Cu cei trei pași simpli care urmează, învățați cum să faceți tampon TBE. Nu ar trebui să dureze mai mult de 30 de minute pentru a crea acest buffer. Iată cum:

Soluție stoc de EDTA

O soluție EDTA (acid etilen-diamină tetraacetic) trebuie pregătită înainte. EDTA nu va trece complet în soluție până când pH-ul nu este ajustat la circa 8,0. Pentru o soluție stoc de 500 mililitri de EDTA 0,5 M, se cântăresc 93,05 grame de sare disodică EDTA (FW = 372,2). Apoi se dizolvă în 400 ml apă deionizată și se ajustează pH-ul cu NaOH. După aceasta, se completează soluția până la un volum final de 500 mililitri.

Soluție stoc a TBE

Se realizează o soluție stocată de TBE concentrată (5x) prin cântărirea a 54 g bază Tris (FW = 121,14) și 27,5 g acid boric (FW = 61,83) și dizolvarea în aproximativ 900 mililitri de apă deionizată. Apoi se adaugă 20 mililitri de EDTA 0,5 M (pH 8,0) și se ajustează soluția până la un volum final de 1 litru. Această soluție poate fi păstrată la temperatura camerei, dar se va forma un precipitat în soluții mai vechi. Se păstrează tamponul în sticle de sticlă și se aruncă dacă s-a format un precipitat.

Soluția de lucru a TBE

Pentru electroforeza pe gel de agaroză, poate fi utilizat un tampon TBE la o concentrație de 0,5x (diluție 1:10 a stocului concentrat). Se diluează soluția de stoc cu 10 ori în apă deionizată. Concentrațiile finale ale solutului sunt 45 mM Tris-borat și 1 mM EDTA. Tamponul este acum pregătit pentru utilizare în rularea unui gel de agaroză.

De ce ai nevoie

Pentru a face tampon TBE, veți avea nevoie de doar patru substanțe. Celelalte elemente de pe această listă sunt echipamente. Cele patru substanțe necesare sunt sarea disodică EDTA, baza Tris, acidul boric și apa deionizată.

În ceea ce privește echipamentul, veți avea nevoie de un metru de pH și de standarde de calibrare, după caz. În plus, veți avea nevoie de pahare sau flacoane de 600 mililitri și 1500 de mililitri. Rotunjirea nevoilor dvs. de echipament sunt cilindri gradate și agitare bare și se amestecă plăci.

Verificați inventarul din laboratorul pe care îl veți utiliza pentru a vă asigura că aveți tot ce aveți nevoie înainte de a începe. Nimic nu este mai rău decât să vă opriți în mijlocul pregătirii unei soluții pentru că ați ieșit din materialele potrivite. Dacă laboratorul dvs. este la școală sau la locul de muncă, verificați personalul corespunzător pentru a vedea că au toate articolele din stoc. Acest lucru vă poate economisi timp și energie în cele din urmă.