Totul despre enzime de restricție

Endonucleazele de restricție sunt o clasă de enzime care taie moleculele ADN. Fiecare enzimă recunoaște secvențe unice de nucleotide într-o catenă de ADN - de obicei, aproximativ patru până la șase perechi de baze lungi. Secvențele sunt palindromice prin faptul că lanțul ADN complementar are aceeași secvență în direcția inversă. Cu alte cuvinte, ambele fire de ADN sunt tăiate în aceeași locație.

Unde se găsesc aceste enzime

Enzimele de restricție se găsesc în multe tulpini diferite de bacterii în care rolul lor biologic este de a participa la apărarea celulară. Aceste enzime restricționează ADN-ul străin (viral) care intră în celule prin distrugerea acestora. Celulele gazdă au un sistem de modificare a restricțiilor care le metilază ADN-ul propriu în locurile specifice pentru respectivele enzime de restricție, protejându-le astfel de scindare. Au fost descoperite peste 800 de enzime cunoscute care recunosc mai mult de 100 de secvențe nucleotidice diferite.

Tipuri de enzime de restricție

Există cinci tipuri diferite de enzime de restricție. Tipul I taie ADN-ul în locații aleatorii până la 1000 sau mai multe perechi de baze de la locul de recunoaștere. Tipul III se taie la aproximativ 25 de perechi de baze de pe site. Ambele tipuri necesită ATP și pot fi enzime mari cu subunități multiple. Enzimele de tip II, care sunt utilizate preponderent în biotehnologie, taie ADN-ul în secvența recunoscută fără a avea nevoie de ATP și sunt mai mici și mai simple.

Enzimele de restricție de tip II sunt denumite în funcție de speciile bacteriene din care sunt izolate. De exemplu, enzima EcoRI a fost izolată din E. coli. Majoritatea publicului este familiarizat cu focarele de E. coli din alimente.

Enzimele de restricție tip II pot genera două tipuri diferite de tăieturi în funcție de faptul dacă taie ambele fire în centrul secvenței de recunoaștere sau fiecare catenă mai aproape de un capăt al secvenței de recunoaștere.

Prima tăiere va genera "capete bont" fără console de nucleotide. Acesta din urmă generează capete "lipicioase" sau "coezive", deoarece fiecare fragment rezultat din ADN are un exces care completează celelalte fragmente. Ambele sunt utile în genetica moleculară pentru realizarea ADN-ului recombinant și a proteinelor. Această formă de ADN se evidențiază deoarece este produsă prin legarea (îmbinarea) a două sau mai multe fire diferite care nu au fost legate inițial împreună.

Enzimele de tip IV recunosc ADN-ul metilic și enzimele de tip V utilizează ARN-uri pentru a tăia secvențele asupra organismelor invadatoare care nu sunt palindromice.

Utilizarea în biotehnologie

Enzimele de restricție sunt utilizate în biotehnologie pentru a reduce ADN-ul în fire mai mici pentru a studia diferențele de lungime a fragmentului în rândul indivizilor. Aceasta se referă la polimorfismul lungimii fragmentului de restricție (RFLP). Sunt de asemenea folosite pentru clonarea genelor.

Tehnicile RFLP au fost utilizate pentru a determina faptul că indivizii sau grupurile de indivizi au diferențe distincte în secvențele genelor și modele de scindare a restricției în anumite zone ale genomului. Cunoașterea acestor zone unice reprezintă baza pentru amprentarea ADN-ului. Fiecare dintre aceste metode depinde de utilizarea electroforezei pe gel de agaroză pentru separarea fragmentelor ADN. Tamponul TBE, care este alcătuit din baza Tris, acidul boric și EDTA, este utilizat în mod obișnuit pentru electroforeza pe gel de agaroză pentru a examina produsele ADN.

Utilizați în clonare

Clonarea necesită adesea inserarea unei gene într-o plasmidă, care este un tip de bucată de ADN. Enzimele de restricție pot ajuta cu acest proces din cauza consolelor monocatenare pe care le părăsesc atunci când fac tăieturi. ADN ligaza, o enzimă separată, poate uni împreună două molecule de ADN cu capete de potrivire.

Astfel, prin utilizarea enzimelor de restricție cu enzime ADN ligază, se pot folosi bucăți de ADN din diferite surse pentru a crea o moleculă de ADN unică.