Tehnici de secvențiere a ADN

Domeniul biotehnologiei este unul de schimbare constantă. Creșterea și dezvoltarea rapidă a cercetării de ultimă oră depind de inovația și creativitatea oamenilor de știință și de capacitatea acestora de a vedea potențialul într-o tehnică moleculară de bază și de a le aplica noilor procese. Apariția PCR a deschis numeroase uși în cercetarea genetică, incluzând un mijloc de analiză ADN și identificarea diferitelor gene bazate pe secvențele lor ADN. Secvențierea ADN-ului depinde, de asemenea, de capacitatea noastră de a utiliza electroforeza în gel pentru a separa firele de ADN care diferă în dimensiune cu cât mai puțin o pereche de bază.

Secvențierea ADN-ului

La sfarsitul anilor 1970, au fost inventate doua tehnici de secventiere ADN pentru molecule de ADN mai lungi: metoda Sanger (sau dideoxi) si metoda Maxam-Gilbert (clivare chimica). Metoda Maxam-Gilbert se bazează pe scindarea specifică nucleotidelor prin substanțe chimice și este utilizată cel mai bine la secvența oligonucleotidelor (polimeri de nucleotide scurți, de obicei mai mici de 50 de perechi de lungimi). Metoda Sanger este mai frecvent utilizată, deoarece sa dovedit a fi mai ușor de aplicat din punct de vedere tehnic și, odată cu apariția PCR și automatizarea tehnicii, este ușor de aplicat pe lungimile de ADN, inclusiv unele gene întregi.

Această tehnică se bazează pe terminarea lanțului de către dideoxinucleotide în timpul reacțiilor de alungire PCR.

Metoda Sanger

În metoda Sanger, lanțul de ADN care urmează să fie analizat este utilizat ca șablon și se utilizează polimeraza ADN, într-o reacție PCR, pentru a genera catene complementare folosind primeri. Se prepară patru amestecuri diferite de reacție PCR, fiecare conținând un anumit procent de analogi dideoxinucleozid trifosfat (ddNTP) la una din cele patru nucleotide (ATP, CTP, GTP sau TTP).

Sinteza noului fir ADN continuă până când unul dintre acești analogi este încorporat, moment în care lanțul este trunchiat prematură. Fiecare reacție PCR va ajunge să conțină un amestec de lungimi diferite de fire ADN, toate terminând cu nucleotida care a fost marcată cu dideoxi pentru acea reacție. Gelul electrophoresis este apoi folosit pentru a separa toroanele celor patru reacții, în patru benzi separate și pentru a determina secvența șablonului original bazat pe ce lungimi de fire se termină cu ce nucleotidă.

În reacția automată Sanger se utilizează grunduri care sunt etichetate cu patru etichete fluorescente colorate diferite. Reacțiile PCR, în prezența diferitelor dideoxinucleotide, sunt realizate așa cum s-a descris mai sus. Totuși, în continuare, cele patru amestecuri de reacție sunt apoi combinate și aplicate într-o singură bandă a unui gel. Culoarea fiecărui fragment este detectată utilizând un fascicul laser și informațiile sunt colectate de un computer care generează cromatograme care prezintă vârfuri pentru fiecare culoare, din care poate fi determinată secvența ADN-ului șablon.

În mod tipic, metoda de secvențiere automată este exactă numai pentru secvențe până la un maxim de aproximativ 700-800 perechi de perechi în lungime. Cu toate acestea, este posibil să se obțină secvențe complete de gene mai mari și, de fapt, genomi întregi, folosind metode pas cu pas, cum ar fi primare de mers și secvențiere shotgun.

În Primer Walking, o porțiune funcțională a unei gene mai mari este secvențiată folosind metoda Sanger. Primerii noi sunt generați dintr-un segment fiabil al secvenței și sunt utilizați pentru a continua secvențierea porțiunii genei care a fost în afara domeniului reacțiilor originale.

Urmărirea secvenței de arme presupune tăierea aleatorie a segmentului ADN de interes în fragmente mai potrivite (ușor de gestionat), secvențierea fiecărui fragment și aranjarea pieselor pe baza secvențelor suprapuse. Această tehnică a fost ușurată prin aplicarea de software de calculator pentru aranjarea pieselor suprapuse.